A型流感病毒NS1蛋白磷酸化研究

【摘要】A型流感病毒(influenzavirusA)属于正粘病毒科,流感病毒属；基因组为单股负链RNA,含有大小不同的8个独立的RNA片段,其中非结构蛋白1(nonstructuralprotein1,NS1)由第8条RNA编码的,相对分子量约为26kDa,含有230-237aa。NS1在病毒粒子内不存在,仅存在于病毒感染的细胞中。在WSN感染早期,NS1主要聚集在感染细胞的核内,但在晚期主要定位在细胞质中。NS1主要有两个结构域,N-末端的RNA结合结构(RNA-bindingdomain,RBD),主要与各类RNA结合；C-末端的效应结构域(effectordomain),参与同宿主细胞内各种蛋白质相互作用。NS1是一种多功能蛋白质,通过与宿主蛋白的相互作用以实现病毒逃逸天然免疫功能,包括RIG-Ⅰ、Trim25、IKK、CPSF30、PABPⅡ、eIF4GⅠ、PABPⅠ和PKR等；以及NS1同病毒复制中间体RNA结合,阻断宿主模式识别受体(PRR)识别病原相关分子模式(PAMP),通过与这些作用,NS1可以抑制宿主蛋白转录翻译,调节细胞凋亡,以实现病毒的高效复制和感染。病毒与宿主免疫系统之间的相互作用的结果决定了病毒感染的进程。一方面,宿主细胞受到病毒的感染后会很快启动一系列的抗病毒免疫反应,抑制病毒的复制和病毒蛋白的合成；另一方面,病毒自身许多蛋白具有拮抗宿主细胞抗病毒免疫作用的功能,以利于病毒在宿主体内的复制和再感染。流感蛋白编码的NS1就具有拮抗宿主细胞抗病毒作用的功能,能与多种宿主因子发生相互作用,抵抗宿主的免疫防御作用。除对抗宿主免疫系统外,NS1蛋白还能促进病毒自身的复制和翻译效率。NS1蛋白与vRNP复合物中NP蛋白的相互作用促进了病毒的复制；NS1蛋白通过与宿主eIF4GⅠ的相互作用募集了翻译起始因子到病毒的mRNA上,有效提高了病毒蛋白的翻译水平。本研究通过磷酸化质谱实验鉴定了WSN毒株NS1上的磷酸化位点,对这些位点进行各种点突变置换,以确定其功能。在十二质粒系统Ben8质粒(表达NS1蛋白)构建各种点突变,然后进行病毒拯救,发现不同位点的点突变(T80E和S83D)所产生的病毒滴度和病毒生长曲线与WT相比存在一定差异。通过在PCMV-MYC载体上构建各种点突变体,证明了在真核细胞水平,这些位点的点突变均没有改变NS1蛋白的细胞定位。Real-timePCR实验显示突变体T80E和$83D对于IFN的抑制作用较NS1WT有所减弱；通过NS1蛋白与poly(U)的结合实验,发现突变体T80E的NS1蛋白与RNA的亲和力存在差异。推测是由于T80E与RNA结合力的减弱导致宿主模式识别受体PRMP对病毒复制过程中产生的RNA结合增强,因此突变体T80E对IFN的抑制效果减弱。NS1蛋白的磷酸化修饰调控影响了流感病毒的复制效率,以及病毒与宿主的相互作用。通过对NSl蛋白磷酸化的研究,我们进一步了解了病毒与宿主蛋白的相互作用,以及其在NS1抑制天然免疫中发挥的功能。
【作者】曹帅帅；
【导师】杨利敏；刘文军；
【作者基本信息】安徽大学，微生物，2014，硕士
【关键词】流感病毒；NS1蛋白；干扰素；抗病毒活性；毒力；

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